Principios básicos de la tecnología de electroforesis.

La tecnología de electroforesis se basa en los principios básicos de la electroforesis y se ve afectada por factores internos de las partículas electroforéticas y factores externos del campo eléctrico.
Principios básicos

En circunstancias normales, las moléculas materiales generalmente no tienen carga, es decir, la cantidad de cargas positivas y negativas que llevan es igual, mostrando neutralidad eléctrica. Sin embargo, debido a su propia disociación o la adsorción de otras partículas cargadas en su superficie, lleva una carga negativa o positiva y la sustancia migrará hacia el electrodo positivo o negativo en el campo eléctrico. Existen muchos tipos de partículas materiales cargadas, que pueden ser iones o macromoléculas biológicas, como proteínas, ácidos nucleicos, partículas de virus e incluso orgánulos.
Las moléculas de proteínas están compuestas de aminoácidos, que son electrolitos anfóteros típicos y pueden disociarse en grupos amino cargados positivamente (-NH3+) y grupos carboxilo cargados negativamente (-COO-) en solución. La naturaleza de la carga de las moléculas de proteínas y la cantidad de carga que llevan dependen principalmente de sus propiedades y de la fuerza iónica (fuerza iónica, I) y el pH de la solución.
Bajo una determinada condición de pH, el número de cargas positivas y negativas de las moléculas de proteína es exactamente igual y la carga neta de las moléculas de proteína es cero. En este momento, el pH de la solución es el punto isoeléctrico (pI) de la proteína.
Cuando el pH de la solución = pI, las moléculas de proteína están descargadas y no se mueven en el campo eléctrico;
Cuando el pH de la solución > pI, las moléculas de proteína se cargan negativamente y se mueven hacia el electrodo positivo;
Cuando el pH de la solución <pI, las moléculas de proteína se cargan positivamente y se mueven hacia el electrodo negativo.

Los ácidos nucleicos son similares a las proteínas y también son electrolitos anfóteros. Las cadenas de polinucleótidos de las moléculas de ADN y ARN tienen grupos fosfato ácidos y bases alcalinas, pero debido a que la acidez del grupo fosfato es más fuerte que la alcalinidad de la base, en soluciones neutras o alcalinas, las moléculas de ácido nucleico generalmente parecen ácidas y llevan cargas negativas. , y migran hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico de CC.

Factores de influencia
Factores internos
La velocidad electroforética está relacionada con las características de las propias partículas, como la carga positiva y negativa, el tamaño y forma de las partículas, la tendencia de disociación, las propiedades anfóteras, el grado de hidratación, etc. En general, cuanto más neta carga que lleva una partícula, cuanto más pequeña es la partícula y cuanto más cerca está la forma de una esfera, más rápido se mueve la partícula en el campo eléctrico; de lo contrario, más lento se mueve.
En términos generales, las moléculas lineales de ADN bicatenario no tienen conformaciones complejas que afecten la velocidad electroforética. En la electroforesis en gel, el logaritmo comúnmente utilizado de su peso molecular relativo es inversamente proporcional a la velocidad electroforética; pero la velocidad electroforética del ADN plasmídico se ve muy afectada por la conformación espacial de la molécula. La velocidad relativa de la velocidad electroforética del ADN plasmídico con el mismo peso molecular es: tipo de bucle cerrado> tipo lineal> tipo de bucle semiabierto. Las moléculas de ARN son hebras simples con estructuras locales de doble hélice, por lo que la velocidad electroforética de las moléculas de ARN depende no sólo del tamaño de la molécula, sino también principalmente de su conformación espacial.

Factores externos
1. Intensidad del campo eléctrico Cuanto mayor es la intensidad del campo eléctrico, mayor es la fuerza del campo eléctrico sobre la partícula cargada y mayor es la velocidad de nado, y viceversa. Según la diferencia en la intensidad del campo eléctrico, la electroforesis se puede dividir en dos categorías:
① Electroforesis a presión normal (2~10V/cm): el voltaje es generalmente de 100~500V. Adecuado para separar macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos, el tiempo de separación es relativamente largo, desde varias horas hasta varios días.

② Electroforesis de alto voltaje (50~200V/cm): el voltaje es generalmente de 2000~10000V. Se utiliza principalmente para separar moléculas pequeñas, como aminoácidos, péptidos, nucleótidos, azúcares, etc. El tiempo de electroforesis requerido es muy corto, incluso unos pocos minutos.
2. Las propiedades de la solución incluyen principalmente el pH del tampón del electrodo y la solución de muestra, la fuerza iónica y la viscosidad media.
(1) pH de la solución: durante la electroforesis, se debe utilizar un tampón como solución de electrodo para mantener un pH de solución estable. El pH de la solución determina el grado de disociación de las partículas cargadas; también determina el número de cargas que lleva la sustancia. Para electrolitos anfóteros como proteínas, aminoácidos y ácidos nucleicos, cuanto más alejado esté el pH del tampón del pI de la sustancia a separar, más carga llevarán las partículas y más rápida será la velocidad de electroforesis; de lo contrario, más lento será. Por tanto, elegir un pH adecuado para que el número de cargas que llevan las sustancias a separar sea relativamente diferente favorece su separación durante la electroforesis. La mayoría de las electroforesis de proteínas utilizan tampones de barbitúricos o ácido bórico con un pH de 8,2 a 8,8. En este momento, las proteínas séricas generalmente están cargadas negativamente.

La electroforesis de ácidos nucleicos suele utilizar uno de los siguientes tres sistemas tampón: tampón TAE [ácido tris-acético-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)], tampón TBE (ácido tris-bórico) o tampón TPE (ácido tris-fosfórico). Las moléculas de ADN están cargadas negativamente en estos tampones.

(2) Fuerza iónica de la solución: la fuerza eléctrica neta generada por todos los tipos de iones se llama fuerza iónica. El nivel de fuerza iónica depende del número total de cargas iónicas y no tiene nada que ver con sus propiedades. Cuanto mayor sea la fuerza iónica de la solución, más lenta será la velocidad de nado de las partículas cargadas; por el contrario, cuanto más rápida sea la velocidad de nado de las partículas cargadas. La razón es que las partículas cargadas atraen iones con cargas opuestas para que se reúnan a su alrededor, formando una atmósfera iónica. La atmósfera iónica reduce la carga de las partículas y aumenta la resistencia al movimiento de las mismas, reduciendo así la velocidad electroforética. Además, si la fuerza iónica es demasiado alta, el calor generado cuando pasa una gran cantidad de corriente puede provocar la evaporación de una gran cantidad de agua. Sin embargo, si la fuerza iónica es demasiado baja, la concentración total y la capacidad tampón de la solución tampón se reducirán, dificultando el mantenimiento del pH de la solución, afectando así la carga de las partículas, lo que resultará en una disminución de la corriente. difusión severa y resolución electroforética reducida. Durante la electroforesis, la fuerza iónica de la solución es generalmente de 0,02 a 0,20 mol/l.
(3) Viscosidad de la solución: como se mencionó anteriormente, la movilidad electroforética de las partículas es inversamente proporcional a la viscosidad del medio de la solución. Por lo tanto, si la viscosidad de la solución es demasiado baja o demasiado alta, inevitablemente afectará la velocidad de la electroforesis.
3. Electroósmosis En un campo eléctrico, el movimiento relativo de una solución a un medio de soporte sólido se llama electroósmosis. Cuando el medio de soporte no es una sustancia absolutamente inerte, la solución cercana al medio de soporte suele estar relativamente cargada y la solución se mueve mientras transporta las partículas. Por lo tanto, la velocidad de nado aparente de una partícula cargada es la suma vectorial de la velocidad de nado de la propia partícula y la velocidad de nado de la partícula transportada por la solución. Cuando las dos direcciones son consistentes, la velocidad de nado de la partícula se acelera, y cuando las direcciones son opuestas, la velocidad de nado de la partícula se reduce.
4. Adsorción La superficie del medio de soporte tiene un cierto efecto de adsorción en la muestra, que puede retener la sustancia que se va a separar y reducir la velocidad de la electroforesis, lo que hace que la muestra se forme cola y reduzca la resolución.

5. Calor de Joule El calor generado por el paso de la corriente durante la electroforesis se llama calor de Joule y su valor es proporcional al cuadrado de la intensidad de la corriente. El calor Joule puede aumentar la temperatura de la solución tampón, reducir la viscosidad del medio, intensificar el movimiento molecular y reducir la resolución. Cuando el calor Joule es demasiado alto, también quemará el papel de filtro, derretirá el gel de agarosa o quemará el medio de soporte del gel de poliacrilamida. La influencia del efecto térmico en la electroforesis se puede reducir controlando el voltaje o la corriente, o instalando un dispositivo de enfriamiento y disipación de calor.