Puntos Clave en el Funcionamiento de la Prueba ELISA

Para obtener resultados precisos y fiables de la prueba ELISA, es fundamental contar con reactivos de alta calidad, una buena instrumentación y un funcionamiento correcto. Los procedimientos de ELISA varían según el portador de fase sólida utilizado. Las pruebas ELISA en placa se utilizan generalmente en análisis médicos domésticos. Este artículo describe los puntos clave de cada paso del procedimiento ELISA en placa. Las pruebas ELISA con microesferas, en tubo y con microesferas magnéticas se utilizan con instrumentación especializada. Se proporcionan instrucciones detalladas para cada tipo de prueba ELISA. El estricto cumplimiento de estas instrucciones garantizará resultados precisos.

Recolección y Almacenamiento de Muestras

Se puede utilizar una amplia gama de muestras para los ensayos ELISA. Los fluidos corporales (como el suero), las secreciones (saliva) y las excretas (como la orina y las heces) se pueden utilizar para analizar anticuerpos o componentes antigénicos específicos. Algunas muestras se pueden analizar directamente (como el suero y la orina), mientras que otras requieren pretratamiento (como las heces y ciertas secreciones). La mayoría de las pruebas ELISA utilizan suero como muestra. Con la excepción del fibrinógeno y los anticoagulantes, el plasma tiene una composición similar a la del suero. Las muestras de plasma requieren el uso de un anticoagulante, mientras que las muestras de suero pueden obtenerse después de que el suero se haya coagulado naturalmente y el coágulo se haya retraído. Salvo en circunstancias especiales, el suero se utiliza como muestra para las pruebas en laboratorios médicos. El plasma y el suero pueden utilizarse por igual en las pruebas ELISA. Las muestras de suero pueden recolectarse mediante métodos convencionales, pero se debe tener cuidado para evitar la hemólisis. La lisis de los glóbulos rojos libera sustancias con actividad peroxidasa. En las pruebas ELISA marcadas con HRP, las muestras hemolizadas pueden aumentar el desarrollo de color inespecífico.

Las muestras de suero deben analizarse en fresco. La contaminación bacteriana puede causar HRP endógena, que también puede producir reacciones falsas positivas. El almacenamiento prolongado en el refrigerador puede provocar polimerización, lo que puede aumentar el fondo en las pruebas ELISA indirectas.

En general, las muestras de suero analizadas en los últimos 5 días pueden almacenarse a 4 °C; las analizadas durante una semana deben conservarse en hielo. Tras la descongelación, el suero congelado presentará proteínas localmente concentradas y una distribución desigual. Mezcle bien y con cuidado para evitar burbujas de aire. Mezcle invirtiendo la muestra, pero evite agitarla vigorosamente en una licuadora. Las muestras de suero turbias o precipitadas deben centrifugarse o filtrarse para clarificarlas antes de la prueba. La congelación y descongelación repetidas pueden provocar una disminución de los títulos de anticuerpos. Por lo tanto, si las muestras de suero para la prueba de anticuerpos deben almacenarse para múltiples pruebas, deben dividirse en alícuotas y almacenarse en hielo. El suero debe almacenarse asépticamente desde el momento de su recolección y se pueden añadir los conservantes adecuados.

Preparación de reactivos

Prepare los reactivos necesarios para el experimento según las instrucciones del kit. El agua destilada o desionizada utilizada en ELISA, incluida la utilizada para el lavado, debe ser fresca y de alta calidad. Los tampones caseros deben calibrarse con un medidor de pH. Los reactivos retirados del refrigerador deben dejarse que alcancen la temperatura ambiente antes de su uso. Cualquier porción no utilizada del kit debe devolverse inmediatamente al refrigerador.

Adición de la Muestra

Una prueba ELISA generalmente implica tres pasos para la adición de la muestra: adición de la muestra, adición del conjugado enzimático y adición del sustrato. Al agregar las muestras, colóquelas en el fondo de los pocillos de la placa ELISA, evitando las paredes superiores. Tenga cuidado de no salpicar ni formar burbujas.

Las muestras se agregan generalmente con una micropipeta, añadiendo la cantidad prescrita a los pocillos. La punta de la pipeta debe cambiarse cada vez para evitar la contaminación cruzada. También se pueden usar tubos de plástico desechables para la adición de la muestra. Para ensayos (como ELISA indirecto) que requieren suero diluido, dilúyalo en un tubo de ensayo hasta la dilución prescrita antes de agregar la muestra. Alternativamente, agregue el diluyente a los pocillos, luego agregue la muestra de suero y agite en un microagitador durante 1 minuto para asegurar la mezcla. Al agregar la solución de conjugado enzimático y la solución de sustrato, se puede usar una pipeta multicanal cuantitativa para agilizar el proceso de adición.

Incubación
En ELISA, generalmente hay dos reacciones antígeno-anticuerpo: después de la adición de la muestra y después de la adición del conjugado enzimático. La finalización de la reacción antígeno-anticuerpo requiere una temperatura y un tiempo específicos. Este proceso de incubación se denomina incubación. Algunos lo llaman "incubación", lo cual parece inapropiado en el contexto de ELISA.

ELISA es un inmunoensayo en fase sólida, en el que la unión antígeno-anticuerpo se produce únicamente en la superficie sólida. Por ejemplo, en el método de sándwich recubierto con anticuerpo, al añadir una muestra a un pocillo de la placa, no todos los antígenos presentes tienen la misma probabilidad de unirse a la fase sólida. Solo el antígeno de la capa de solución más cercana a la pared del pocillo entra en contacto directo con el anticuerpo. Este es un proceso de equilibrio gradual que requiere difusión para alcanzar el punto final de la reacción. Lo mismo ocurre con la unión del anticuerpo marcado con enzima, añadido posteriormente, al antígeno en fase sólida. Por ello, las reacciones ELISA siempre requieren un tiempo de incubación determinado.

Las temperaturas de incubación habituales incluyen 43 °C, 37 °C, temperatura ambiente y 4 °C (temperatura del refrigerador). 37 °C es una temperatura de incubación comúnmente utilizada en el laboratorio y es la temperatura ideal para la mayoría de las uniones antígeno-anticuerpo. Al desarrollar métodos ELISA para estudios de cinética de reacción, los experimentos han demostrado que la formación de producto suele alcanzar su punto máximo después de una o dos horas a 37 °C para dos reacciones antígeno-anticuerpo. Para acelerar la reacción, se puede aumentar la temperatura; algunos experimentos se realizan a 43 °C, pero no se recomiendan temperaturas más altas. Las reacciones antígeno-anticuerpo son más completas a 4 °C. En radioinmunoensayos, las reacciones suelen refrigerarse durante la noche para maximizar la precipitación. Sin embargo, esto no se suele utilizar en ELISA porque requiere demasiado tiempo.

Se suele utilizar un baño de agua para conservar el calor, excepto en algunos instrumentos ELISA equipados con un bloque calefactor específico. La placa ELISA puede colocarse en un baño de agua con el fondo de la placa tocando la superficie del agua para permitir un rápido equilibrio de la temperatura. Para evitar la evaporación, se debe cubrir la placa. Como alternativa, se pueden cubrir los pocillos con film transparente o film plástico, permitiendo que la placa flote en la superficie del agua. Si se utiliza una incubadora, la placa ELISA debe colocarse en una cámara humidificada de un material con buena conductividad térmica, como el metal. Se debe colocar una gasa húmeda en el fondo de la cámara y la placa encima. La cámara humidificada debe precalentarse a la temperatura especificada en la incubadora, especialmente a bajas temperaturas. Tanto si se incuba en un baño de agua como en una cámara humidificada, las placas de reacción no deben apilarse para asegurar un rápido equilibrio de la temperatura. Para la incubación a temperatura ambiente, la temperatura de funcionamiento debe estar estrictamente dentro del rango especificado. La temperatura ambiente estándar es de 20-25 °C, pero el funcionamiento específico puede controlarse según las instrucciones. Durante la incubación a temperatura ambiente, la placa ELISA puede simplemente colocarse plana sobre la mesa de trabajo. Se debe tener cuidado de asegurar que la temperatura y el tiempo de incubación se especifiquen con precisión. Para garantizar esto, una persona no debe analizar más de dos placas a la vez.